Ola Isene var opprinnelig sanger, men gikk etter hvert over til talescenen og var en allsidig skuespiller ved Det Nye Teater, Folketeatret og Nationaltheatret.
Isene vokste opp i Kristiania, der faren var leder av avholdsorganisasjonen Blå Kors. Etter middelskolen hadde han forskjellige jobber, men drev sangstudier ved siden av, først ved Musikkonservatoriet i Kristiania og deretter i Stockholm hos Haldis Ingebjart, som senere ble hans hustru.
Isene debuterte som operettesanger på Mayolteatret i Kristiania 1923 og spilte på Intimteatret 1926. I operafremføringer viste han tydelig skuespillertalent og hadde store roller som Amonasro i Aïda og som Beckmesser i Wagners Mestersangerne i Nürnberg; sistnevnte ble fremført på Nationaltheatret 1932 i samarbeid med Filharmonisk Selskap. 1935 sang han hovedrollen i Jaromir Weinbergers opera Schwanda på Centralteatret.
1929 hadde Isene oppdrag som “stand-in” for Al Jolson under visning av den første lydfilmen, The Jazz Singer, på kinoen Röda Kvarn i Stockholm. Denne kinoen hadde ikke utstyr til å spille av lydfilm, så Isene stod hver kveld ved siden av lerretet og sang Jolsons solopartier, akkompagnert av kinoens orkester og kor.
Isene debuterte som skuespiller 1937. Året etter ble han ansatt på Trøndelag Teater og gikk dermed helt over til talescenen. Han var deretter på Det Nye Teater 1939–46, og begge steder utmerket han seg som karakterskuespiller gjennom realistiske skikkelser som professor Mensch i Han sitter ved smeltedigelen av Kaj Munk og tittelrollene i J. B. Priestleys Johnson går videre og Hjalmar Bergmans Swedenhielms. I Shakespeares Troll kan temmes spilte han en festlig, forelsket Petruccio.
1946 kom Isene for første gang til Nationaltheatret og fikk der spille lettsindige sjarmører som Bendik i Shakespeares Stor ståhei for ingenting, Løven i Gerts Have av Gunnar Heiberg og Jens Waage i Tre par av Alexander Kielland. Rollen som slagsbroren Bill Walker i Major Barbara av G. B. Shaw gjorde han med humør og kraft. Mer dybde var det over rollene som svigersønnen Axel i Pelikanen av August Strindberg og som Stanley i Tennessee Williams' En sporvogn til begjær. Han gjorde også stor suksess i hovedrollen Hickey i Ismannen kommer av Eugene O'Neill.
Isene var ansatt på Folketeatret 1952–59, og fikk 1953 Kritikerprisen for sin rolle som presten i Jeg har en venn av Maxwell Anderson og Kurt Weill. Han gjorde seg også bemerket som faren i Anne Franks Dagbok. Fra 1959 var han tilbake på Nationaltheatret og ble der til han gikk av med pensjon 1969. I denne siste perioden utmerket han seg i rollene som Monsewer i Gisselet av Brendan Behan og som generalen i Toreadorvalsen av Jean Anouilh. Noe av det siste han gjorde på Nationaltheatret, var å skildre lofferen Paradis-Oskar i Astrid Lindgrens uforglemmelige Rasmus på loffen (1968). I denne rollen erobret han scenen til barnas store begeistring.
Ola Isene filmdebuterte 1931 i den svenske folkekomedien Kärlek og landstorm. Hans første rolle i norsk film var som banksjefen i Tancred Ibsens Tørres Snørtevold (1940). Isene ble mye brukt i norske filmer, og han hadde ledende roller i Englandsfarere (1946) og Blodveien (1955). I Tancred Ibsens filmatisering av Vildanden (1963) spilte han rollen som gamle Ekdal. Men han spilte også i komedier som Olsenbanden og Dynamitt-Harry. Sin siste filmrolle hadde han 1973, samme året som han døde, da han spilte klokkeren i Jan Erik Dürings drama Knut Formos siste jakt.
Isene gjorde også suksess som grammofonartist, med slageren Genser'n te'n Johansen fra 1955 av Reidar Anthonsen og Bjarne Amdahl.