Leonhard Stejneger var selvlært som zoolog og arbeidet som virveldyrzoolog ved Smithsonian Institution, United States Natural Museum i 62 år.
Han vokste opp i en velstående familie i Bergen. Her ble han tidlig interessert i dyrelivet og foretok registreringer og innsamlinger, og dette satte ham i kontakt med Bergens Museum og personalet der. Etter skolegang i hjembyen og et års opphold sammen med familien i Meran i Sør-Tirol for morens helses skyld reiste han 1870 til Christiania for å ta examen artium og deretter studere ved universitetet. Han tok anneneksamen 1871 og startet på medisinstudiet. I studietiden publiserte han flere zoologiske artikler, og han søkte en ledig konservatorstilling ved Bergens Museum 1873, men fikk den ikke. Deretter avbrøt han medisinstudiet og gikk over til jus. Han endret også skrivemåten av slektsnavnet. 1875 ble han cand.jur. og returnerte til Bergen, hvor han gikk inn i farens forretning som prokurist, samtidig med at han fortsatte sine naturvitenskapelige studier på egen hånd. 1876 giftet han seg med Anna Norman.
Stejneger opprettholdt sin zoologiske interesse og hadde en omfattende kontakt og korrespondanse med ledende zoologer innen- og utenlands. Frem til 1880 publiserte han en rekke ornitologiske artikler. I samme periode gikk farens forretning nedoverbakke, for så å gå konkurs 1880. Med de dårlige fremtidsutsiktene hjemme bestemte Stejneger seg nå for å satse på en fremtidig karriere som zoolog, og etter råd fra den tyske ornitologen Jean Cannabis valgte han å forsøke lykken i Amerika. Imidlertid fikk han ikke sin kone med på dette, og de bestemte seg for å skilles.
Høsten 1881 reiste Stejneger over til USA og troppet opp hos professor S. F. Baird ved Smithsonian Institution (SI), som han hadde korrespondert med, og søkte om arbeid. Han ble straks ansatt i fuglesamlingen, og våren 1882 ble han sendt som feltzoolog til Kommandørøyene øst for Sibir, hvor han overvintret på Beringøya for å studere pelssel. Da han returnerte til San Francisco, hadde han foruten en masse data om pelssel også med seg rester etter de utdødde dyrene Stellers sjøku og pallasskarv.
1884 ble Stejneger assisterende konservator ved fugleavdelingen og fem år senere konservator for krypdyr- og amfibiesamlingen. 1911 ble han hovedkonservator for biologi ved SI, en stilling han hadde til sin død 1943. En spesiell resolusjon fra president Hoover fritok ham fra aldersgrenseloven.
Stejnegers faglige kunnskaper, omgjengelighet og juridiske ballast gjorde sitt til at han først ble trukket inn som medlem i en undersøkelseskommisjon knyttet til pelsselspørsmålet i det nordlige Stillehavet, for deretter å bli regjeringsoppnevnt medlem i the International Fur-Seal Commision. Dette brakte ham flere ganger tilbake til Kommandørøyene, siste gang 1922.
Gjennom sitt lange yrkesliv skrev Stejneger mye over 100 grunnleggende publikasjoner, vesentlig innen herpetologi (læren om krypdyr og amfibier) og ornitologi, men også om pattedyr. Hans biografiske verk om Georg Wilhelm Steller var, da det utkom 1936, et resultat av 55 års arbeid.
Leonhard Stejneger nøt stor respekt og anerkjennelse innen sitt fagfelt. Han var medlem av Videnskabsselskabet i Kristiania (nå Det Norske Videnskaps-Akademi) fra 1887 og en rekke andre vitenskapelige selskaper og ble æresmedlem i flere av dem. Han ble valgt til livsvarig medlem av Bergens Museum 1893, utnevnt til ridder av 1. klasse av St. Olavs Orden 1906 og æresdoktor ved Universitetet i Oslo 1930. Han har fått flere dyrearter oppkalt etter seg, bl.a. Stejnegers nebbhval Mesoplodon stejnegeri, sjøfuglen Stejnegers petrell Pterodroma longirostris, som han beskrev 1893, og tannfroskarten Eleutherodactylus stejnegerianus.